La serie trata fundamentalmente el desempeño del agente federal Jack Bauer (interpretado por el actor Kiefer Sutherland), en la CTU (Counter Terrorist Unit) o UAT, "Unidad antiterrorista" de Los Ángeles. La serie también se enfoca en las actividades de otros agentes de la UAT, la participación de otras agencias gubernamentales, las acciones de diversos grupos terroristas y la reacciones en la Casa Blanca. La serie transcurre en su mayoría en la ciudad de Los Ángeles, y trata sin comicidad situaciones de amenaza o ataque masivos a la seguridad nacional de Estados Unidos, mostrando incluso la rivalidad entre algunas agencias gubernamentales, aún en tiempo de crisis.

En un formato innovador, el espectador presencia la acción "en tiempo real": cada episodio de una hora representa una hora continua de acción de la trama. Cada temporada (compuesta por 24 capítulos) conforma así un día completo. Las sucesivas temporadas (si bien guardan una relación temporal y fáctica) no son contiguas, y relatan eventos cronológicamente distantes.